微生物的測定——顯微鏡法
2021-09-16 13:22:32
天緯化學小編
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如何測定微生物的數量對于微生物研究至關重要，目前最常用的方法包括顯微鏡法、平板計數法、分光光度法、流式細胞法等，各有優缺點，本文首先介紹顯微鏡法。細胞數量可以通過簡單的顯微鏡觀察和計數進行測定。顯微鏡計數可以對玻片上干燥的樣品或液體樣品進行計數。干燥的樣品可以染色，以增加細胞與其背景之間的對比。對于液體樣品，計數室由刻蝕在載玻片表面的已知面積的正方形網格組成。在顯微鏡下，單位面積網格上的細胞數量可以數出來，每毫升懸浮液的細胞數就能簡單計算出來(如下圖所示)。顯微計數是一種快速簡便的微生物細胞數量估算方法，但存在以下問題：如果沒有特殊的染色技術，就無法區分死細胞和活細胞；實驗的再現性一般；小小的細胞往往很難看的清楚，這可能導致計數不準；如果細胞懸浮液的密度低(少于106個細胞/毫升)，視野中將幾乎沒有細胞；對于運動的細胞，觀察前需要將其殺死(通常用甲醛)或固定；樣品中的雜質會產生誤導。對細胞進行染色是常見的研究手段。例如，DAPI(4，6-聯脒-2-苯基吲哚)能夠染色所有細胞，因為它能夠穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA發生反應產生比自身強20多倍的熒光，DAPI染劑利用紫外光激發，與DNA結合時最大吸收波長為358 nm，最大發射波長461 nm；熒光染料PI(碘化丙啶)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，但染料不能透過細胞膜，常用于死細胞的檢測。因此，DAPI/PI染色經常組合使用，用于檢測細胞的生存狀態。通過將熒光染料附著在特定的核酸探針上，可以制備出對某些生物(群)具有高度特異性的熒光染色劑，這方面用的很多的是熒光原位雜交(FISH)。基于催化特定代謝過程的功能基因的熒光探針也已開發出來，如果細胞被這些探針染色，就可以推斷它們具有行使該代謝的能力，對研究微生物生態很有幫助。
參考資料：
Brock Biology of Microorganisms, 15th Edition
5.6 Microscopic Counts of Microbial Cell numbers
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